Northern Blotting

1.        Stock solution

(1)    5×MOPS

ddH2O                                          400ml

3M NaOAc (pH7.0)                      6.67ml

0.5M EDTA (pH8.0)                         5ml

MOPS                                           10.4g

NaOH                                           ~0.875g to pH7.0

Add ddH2O to 500ml, add 500ul DEPC

Set overnight, autoclave for 15min.

(2)    0.5M Na3PO4 (pH7.2)

ddH2O                                            1800ml

NaH2PO4·H2O                               43.6g

Na2HPO4·7H2O                         183.3g

Add ddH2O to 2l, autoclave for 15min.

(3)    10×SSC

ddH2O                                              1800ml

NaCl                                                  175g

Trisodium citrate                                88.2g

Adjust pH to 7.0 with HCl, add ddH2O to 2l, add 2ml DEPC

Set overnight, autoclave for 15min.

(4)    DEPC ddH2O

(5)    14% SDS

2.        Electrophoresis

(1)    Formaldehyde gel ( Pretreat comb and plate with ethanol and Rnase away)

50ml             100ml               200ml           250ml

Agarose             0.5g              1.0g                 2.0g               2.5g

5×MOPS          10ml             20ml                 40ml              50ml

DEPC H2O       38ml             77.5ml              155ml           194ml


65C H2O bath 10min

Add 37% Formaldehyde  2.7ml           5.4ml                10.8ml          13.5ml

Pour gently

Set 15-20min

(2)    Running buffer (1×MOPS )

250ml             600ml             1000ml

DEPC H2O        200ml             480ml              800ml

5×MOPS             50ml             120ml              200ml

(3)    Sample preparation (30ul)

Formamide                                               15ul

5×MOPS                                                    6ul

formaldehyde                                            4.8ul

RNA                                                          10ug ( less than 4.2ul)

DEPC H2O                                                 add to 30ul

65C 10min, put on ice, add 3ul 10×loading buffer.

(4)    Electrophoresis ( Pretreat tank and cylinder with Sparkleen)

Pre- electrophoresis gel at 5V/cm for 5min

Load samples

Run gel at 4V/cm for 1-2h.

3.        Transfer of RNA from Gel to Membrane

Wash gel with DEPC H2O  3 times ( 20min RT H2O, 10min 65C H2O, 20min RT H2O)

Wash with 10×SSC for 30min

Vacuum blot 90min at 5in pressure, using 10×SSC as transfer buffer

Rinse with 2×SSC for 5min

80C bake 30min.

4.        Hybridization

(1)    (Pre)hybridization solution       50ml ( 30ml for prehybridization, 20ml for hybridization)

0.5M Na3PO4 (pH7.2)                 25ml

14% SDS                                     25ml

(2)    Probe labeling

Probe                                              100ng

ddH2O                                             add to 30ul

boil 5min, put on ice

5×labeling mix                                10ul

d(C,T,G)TP mix (1.5mM)                 2ul

BSA(10mg/ml)                                  2ul

Klenow(5u/ul)                                   1ul

P32-dATP                                         5ul

RT 2hrs, add 2ul 0.5M EDTA, boil 10min, G-50 micro column clean, use for hybridization.

(3)    Prehybridization (65C) for more than 2 hrs( while probe labeling), hybridization (65C) overnight.

(4)    Wash

14% SDS                                               89ml

Na3PO4                                                  10ml

ddH2O                                                    151ml

wash for 2 times at 65C, use 125ml wash solution each time.

(5)    Strip

10×SSC                                                    10ml

14% SDS                                                    35ml

ddH2O                                                     955ml

wash for 2 times in boiling solution, use 500ml solution each time.